สพ.ญ. ณัฏฐณิชา สังข์พราหมณ์ และผู้ช่วยศาสตราจารย์ น.สพ.ดร.วิษณุ วรรณแสวง
ปัญหาขาพิการในการผลิตสัตว์ปีกเนื้อเชิงอุตสาหกรรมเป็นประเด็นสำคัญที่เกิดขึ้นทั่วโลก เนื่องจาก การบูรณาการพัฒนาหลายด้านพร้อมกันทั้งการจัดการ โภชนาการ และพันธุกรรมสัตว์ปีกเนื้อให้มีการเจริญเติบโตอย่างรวดเร็ว เพื่อให้มีประสิทธิภาพการผลิตสูงที่สุดตามความต้องการของตลาด โดยเฉพาะ เนื้อส่วนอก เมื่อผู้ประกอบการได้รับอานิสงส์จากพัฒนาการด้านการผลิตข้างต้น ย่อมต้องเกิดผลข้างเคียงเชิงลบขึ้นได้ นอกเหนือจากปัญหาขาพิการที่ส่งผลกระทบทางเศรษฐกิจ สวัสดิภาพสัตว์ และกระแสต่อต้านจากองค์กรพิทักษ์สวัสดิภาพสัตว์ต่อการเลี้ยงสัตว์ปีกเนื้อโตเร็วที่เกิดขึ้นอย่างกว้างขวางทั้งในยุโรป และอเมริกา
ปัญหาขาพิการที่มีสาเหตุจากโรคไม่ติดเชื้อ แสดงอาการขาอ่อนแรงคล้ายเป็นโรคกระดูกอ่อน (Ricket-like lameness) และโรคทีดี (Tibial dyschondroplasia, TD) แม้ว่า การพัฒนาด้านโภชนาการอาหารสัตว์เปลี่ยนแปลงไปอย่างมากจนกระทั่งระดับของวิตามินดี แคลเซียม และฟอสฟอรัสในสูตรอาหารสัตว์สูงเกินกว่าความต้องการของสัตว์ไปมากแล้วก็ตาม ผู้ผลิตบางรายนิยมใช้วิตามินดี และแร่ธาตุละลายน้ำเสริมโดยมีองค์ประกอบของวิตามินดี แคลเซียม และฟอสฟอรัส เพื่อบรรเทาปัญหา
นักวิจัยจากภาควิชาสรีรวิทยา มหาวิทยาลัยสัตวแพทย์แฮนโนเวอร์ ตีพิมพ์ผลงานวิจัยในวารสารชั้นนำด้านสัตว์ปีกในยุโรป เพื่อประเมินผลการใช้วิตามินดี และแร่ธาตุละลายน้ำ ทั้งด้านผลผลิต คะแนนการเดิน วิเคราะห์ค่าเลือดเพื่อตรวจสอบปริมาณแคลเซียมทั้งหมด ฟอสฟอรัส แคลเซียมอิสระ และความเข้มข้นของวิตามินดี วิเคราะห์แร่ธาตุในกระดูก ความหนาแน่น และความแข็งแรงของกระดูก รวมทั้งการวิเคราะห์ทางชีวเคมีจากโปรตีนแคลบินดิน ดี ๒๘ เค (Calbindin D28K) เป็นต้น
ภาพที่ ๑ ไก่เนื้ออายุน้อยที่ถูกคัดจากโรคกระดูกอ่อน หรือริกเก๊ต สัตว์ป่วยเหล่านี้ยังไม่ตาย แต่ไม่ยอมลุกยืน และเดิน เนื่องจากความเจ็บปวดที่กระดูก (แหล่งภาพ Nipane and Panchbuddhe, 2011)
บทบาทของวิตามินดีต่อสมดุลแร่ธาตุ
ระดับขั้นต่ำของวิตามิน ดี ๓ ในอาหารสำเร็จรูปสำหรับไก่เนื้อ ตามมาตรฐาน NRC (1994) กำหนดไว้เป็น ๒๐๐ ไอยู และตามมาตรฐานอาหารสัตว์ของเยอรมัน (GfE, 1999) เป็น ๔๕๐ ไอยูต่อกิโลกรัมอาหารสำเร็จรูป อย่างไรก็ตาม ไก่เนื้อที่มีการปรับปรุงพันธุกรรมสมัยใหม่ที่เลี้ยงภายใต้ระบบการเลี้ยงเชิงพาณิชย์ อาจมีความต้องการวิตามินดี ๓ ในระดับที่สูงขึ้น ดังนั้น ในภาคสนามการเลี้ยงจริง ผู้ผลิตอาหารสัตว์สำหรับไก่เนื้อจึงใส่วิตามินดี ๓ ไว้อย่างน้อย ๒๐๐๐ ถึง ๕๐๐๐ ไอยูต่ออาหารสัตว์ ๑ กิโลกรัม
ในสัตว์ปีกที่เลี้ยงภายนอกโรงเรือน วิตามินดี ๓ หรือโคเลคาลซิเฟอรอล (Cholecalciferol) ถูกสังเคราะห์ขึ้นได้เองในผิวหนัง แต่สัตว์ปีกที่เลี้ยงภายในโรงเรือน มีโอกาสได้รับแสงยูวีต่ำ วิตามินดี ๓ จึงเป็นสารอาหารที่มีความจำเป็นในอาหารสัตว์ วิตามินดี ๓ ที่กินเข้าไป หรือสังเคราะห์ขึ้นได้เองจะถูกขนส่งผ่านระบบไหลเวียนเลือดเข้าสู่ตับ หรือสะสมไว้ในเนื้อเยื่อไขมัน
ในตับ วิตามินดี ๓ ถูกเมตาโบไลส์ให้เป็น ๒๕-โอเอช-ดี ๓ (25-OH-cholecalciferol/D3) เป็นรูปของวิตามินดี ๓ ชนิดสำคัญที่ไหลเวียนในกระแสเลือด ความเข้มข้นของ ๒๕-โอเอช-โคเลคาลซิเฟอรอล-ดี ในซีรัมของสัตว์ปีกชนิดต่างๆ เป็นตัวบ่งชี้ที่เชื่อถือได้มากที่สุดของสถานะวิตามินดี ๓
ในไต ๒๕-โอเอช-โคเลคาลซิเฟอรอล-ดี ถูกเมตาโบไลส์ได้เป็น ๑, ๒๕-(โอเอช)๒-ดี ๓ (1, 25-(OH)2-D3) ซึ่งเป็นเมตาโบไลส์ของวิตามินดี ๓ ที่ออกฤทธิ์ได้ดีที่สุด ในทางตรงกันข้ามกับตัวตั้งต้น ๒๕-โอเอช-ดี ๓ ในตับ การสังเคราะห์ ๑, ๒๕-(โอเอช)๒-ดี ๓ ถูกควบคุมอย่างเข้มงวด นอกเหนือจากอวัยวะ หรือเนื้อเยื่อหลายชนิดที่มีความจำเป็นต้องใช้ ๑, ๒๕-(โอเอช)๒-ดี ๓ สำหรับการทำหน้าที่ เช่น ระบบภูมิคุ้มกัน หรือสมอง แต่ยังเกี่ยวข้องกับความสมดุลของแคลเซียม และฟอสฟอรัส (Ca/P-homeostasis) ในร่างกายสัตว์อีกด้วย กรณี แคลเซียม และฟอสฟอรัส ในอาหารสัตว์เป็นไปตามความต้องการของสัตว์ แร่ธาตุเหล่านี้ก็จะถูกดูดซึมเข้าสู่เซลล์ โดยไม่ต้องอาศัยการทำหน้าที่ของวิตามินดี แต่ถ้าระดับแคลเซียม และฟอสฟอรัส ของอาหารในลำไส้อยู่ในระดับต่ำ ๑, ๒๕-(โอเอช)๒-ดี ๓ ก็จะออกฤทธิ์กระตุ้นการดูดซึมผ่านเข้าสู่เซลล์ของแคลเซียม และฟอสฟอรัส การออกฤทธิ์กระตุ้นให้เกิดการขนส่งแคลเซียมผ่านเข้าสู่เซลล์ลำไส้อาศัยการปรากฏของโปรตีนพาหะ (Carrier protein) เรียกว่า “แคลบินดิน ดี ๒๘ เค (Calbindin D28K)” ที่มีหน้าที่เคลื่อนย้ายแคลเซียมจากชั้นเซลล์ส่วนยอดลงไปยังส่วนฐานของเซลล์
ภาพที่ ๒ กลไกการควบคุมสมดุลของแคลเซียมเกี่ยวข้องกับอวัยวะสำคัญ ได้แก่ ตับ ไต ลำไส้เล็ก และกระดูก โดยมีศูนย์ควบคุมเป็นต่อมพาราธัยรอยด์ (แหล่งภาพ Nipane and Panchbuddhe, 2011)
เทคนิคการวิเคราะห์ระดับ แคลเซียม ฟอสฟอรัส วิตามินดี และโปรตีนแคลบิดิน
๑. การตรวจสอบระดับแคบเซียม และฟอสฟอรัสในเลือด นักวิจัยเลือกใช้อุปกรณ์สำหรับการวิเคราะห์ระดับแคลเซียม และฟอสฟอรัสทั้งหมดในซีรัมจากเครื่อง RAPID LAB 348 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield Co., Deerfield, USA) โดยเก็บเลือดผสมกับสารกันเลือดแข็งตัวชนิดเฮปาริน เครื่องวิเคราะห์ค่าโลหิตนี้เป็นชุดตรวจสอบแบบรวดเร็ว ราคาไม่แพง ที่เหมาะสำหรับห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก โดยใช้เลือดเพียง 50-95 ไมโครลิตรเท่านั้นใช้ได้ทั้งหลอดแคปปิลลารี หรือไซริงก์ วิธีการทดสอบนี้ใช้สำหรับมนุษย์ แต่ถูกนำมาประยุกต์นำมาตรวจสอบในสัตว์ปีก
๒. การตรวจระดับวิตามินดี ๓ เป็นการตรวจสอบ ๒๕-โอเอช-ดี ๓ ที่ไหลเวียนในกระแสเลือดจากการเก็บตัวอย่างซีรัม ที่มีข้อดีคือ เก็บรักษาได้ไม่ยาก ไม่ต้องใช้สารกันเลือดแข็งตัวเพิ่มเติม นักวิจัยเลือกใช้ชุดตรวจสอบ 25-OH-Vitamin D direct ELISA (Immunodiagnostik AG Co., Bensheim, German) ก็เป็นวิธีการทดสอบที่ใช้สำหรับมนุษย์เช่นกัน แต่นำมาประยุกต์ใช้ในสัตว์ปีก
๓. การตรวจสอบความแข็งแรงของกระดูกโดยอาศัยการตรวจสอบปริมาณแร่ธาตุในกระดูก ความหนาแน่นของกระดูกจากไก่ทดลองที่อายุ ๑๖ ๒๔ และ ๓๖ วัน ตามหลักการของอาร์คิมิดิส โดยเลาะกระดูกแข้ง (Tibiotarsus) ชั่งน้ำหนัก และใส่ลงในน้ำ แล้วนำมาคำนวณน้ำหนักที่หายไปในน้ำเท่ากับน้ำหนักของกระดูกที่แทนที่น้ำ แล้วคำนวณความหนาแน่นของกระดูก (Bone density) ต่อมากระดูกส่วนอีพิไฟซิสก็นำมาวิเคราะห์ปริมาณน้ำหนักแห้ง (Dry matter, DM) น้ำหนักแห้งไม่รวมไขมัน (Fat free DM) แคลเซียม (ใช้เทคนิค Atomic absorption) และฟอสฟอรัส (ใช้เทคนิค Photometry) ความแข็งแกร่งของส่วนด้ามกระดูกแข้งใช้แข้งขวาแล้วตรวจสอบด้วยเครื่องมือทดสอบวัสดุ “Zwicki-Z2/TNIS” (Zwick-Roell, Ulm, Germany) โดยหลักการของการประเมินความแข็งแรงของกระดูกอาศัยน้ำหนักมากที่สุด (Maximum load, N) ที่สามารถทำให้กระดูกหักได้
๔. การวิเคราะห์โปรตีนแคลบินดิน การตรวจสอบโปรตีนส่วนของเหลวภายในเซลล์ชนิดนี้จะเก็บตัวอย่างจากเนื้อเยื่อลำไส้ นำมาเตรียมให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยวิธีทางกายภาพในบัฟเฟอร์แช่แข็ง (10 mM Tris 0.5 mM ethelenediaminetetracacetic acid, 0.1% sodium dodecyl sulfate, pH7.4) เสริมด้วย 0.1M phenylmethanesulphonylfluoride โดยใช้เครื่องโฮโมจีไนเซอร์ (Braun-Melsungen, German) แล้วปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วรอบสูง ๑๗ ๕๐๐ จี ที่อุญหภูมิ ๔ องศาเซลเซียสเป็นเวลา ๓๐ นาที เก็บส่วนใสที่ประกอบด้วยของเหลวภายในเซลล์ แล้ววัดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้ชุดทดสอบสำเร็จรูปตามหลักการของแบรดฟอร์ด (Bradford method) (Bio-Rad, Germany) แยกโปรตีนส่วนของเหลวภายในเซลล์ปริมาณ ๑๐ ไมโครกรัมบนแผ่นวุ้นโพลีอะคริลาไมด์ความเข้มข้นร้อยละ ๑๔ (Bio-Rad Laboratories GmbH, Germany) แล้วนำโปรตีนมาหยอดลงบนแผ่นไนโตรเซลลูโลส (NC-Membrane Amersham-Hybond-ECL, GE Healthcare, Germany)
ต่อไปเป็นขั้นตอนการตรวจสอบปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนที่ต้องการตรวจสอบชนิด แคลบินดิน โดยอาศัยหลักการของเวสเทิร์นบล็อต ได้แก่ เคมิลูมิเนสเซนส์ (Pierce, Thermo Scientific, Germany) และ ChemiDoc-system (Bio-Rad, Germany)
ภาพที่ ๓ เครื่อง RAPID LAB 348 (Siemens Healthcare Diagnostics, USA) สำหรับวิเคราะห์ระดับแคลเซียม และฟอสฟอรัสทั้งหมดในซีรัม
การให้แร่ธาตุ และวิตามินในรูปแบบละลายน้ำต่อผลผลิต
การให้วิตามินดีเสริมให้กับสัตว์ทดลองในวันที่ ๓ และ ๔ ขนาด ๑๒๕๐ ไอยูต่อตัวต่อวัน ขณะที่ การให้แคลเซียม และฟอสฟอรัสเสริมจะให้ในวันที่ ๕ ๖ ๑๕ ๑๖ ๒๓ และ ๒๔ ปริมาณ ๗๗ มิลลิกรัมต่อน้ำ ๑ ลิตรสำหรับฟอสฟอรัส และ ๒๔ มิลลิกรัมต่ำน้ำ ๑ ลิตรสำหรับแคลเซียม โดยมีสัตว์ทดลองที่ให้ทั้งสองชนิดร่วมกันด้วย
ผลการเสริมแร่ธาตุ และวิตามินละลายน้ำต่อการกินอาหาร น้ำหนักตัว และประสิทธิภาพการแลกเนื้อ ไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (p<0.05) ดังนั้น การเสริมแร่ธาตุ และวิตามินเสริมด้วยการละลายน้ำจึงไม่มีผลแต่อย่างใดต่อผลการเลี้ยงไก่เนื้อ
เมื่อนักวิจัยวิเคราะห์คะแนนท่าเดิน (Gait score) ตามวิธีของ Dawkin และคณะ (2004) กำหนดไว้ระหว่าง ๐ ถึง ๒ ดังนี้ คะแนน ๐ หมายถึง ไม่มีอาการขาพิการ ๑ หมายถึง แสดงอาการขาพิการเล็กน้อย และ ๒ หมายถึง แสดงอาการขาพิการรุนแรง พบว่า ไก่แสดงอาการขาพิการเพิ่มขึ้นตามอายุที่มากขึ้น โดยสัตว์ทดลองทุกกลุ่มที่เสริมแร่ธาตุ และวิตามินมีคะแนนท่าเดินสูงกว่าสัตว์ทดลองกลุ่มควบคุมที่ไม่ให้แร่ธาตุ และวิตามินละลายน้ำที่อายุ ๓๖ วัน
ภาพที่ ๔ แสดงคะแนนท่าเดิน ตามวิธีของ Dawkin และคณะ (2004) ของสัตว์ทดลองทั้ง ๔ กลุ่ม ได้แก่ กลุ่มควบคุม กลุ่ม D ให้วิตามินดีเท่านั้น กลุ่ม CP ให้แร่ธาตุ และ CPD ให้แร่ธาตุ และวิตามินดีละลายน้ำ
ค่าทางโลหิตวิทยา
ความเข้มข้นของระดับแคลเซียม และฟอสฟอรัสทั้งหมด รวมถึง ไอออนของแคลเซียม หรือแคลเซียมอิสระ มีการเปลี่ยนแปลงไปตามอายุในลักษณะที่คล้ายคลึงกันในทุกกลุ่มการทดลอง ยกเว้นที่อายุ ๑๖ วัน กลุ่มควบคุมมีระดับแคลเซียมอิสระที่สูงกว่ากลุ่มทดลองที่พยายามให้แร่ธาตุ และวิตามินดี อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) จากการทดลองที่ผู้วิจัยทำซ้ำเหมือนกันทั้งสองครั้ง ความเข้มข้นของวิตามินดี พบว่า ช่วงเวลาสั้นๆหลังเสริมวิตามินดี ความเข้มข้นของ ๒๕-โอเอช-ดี ๓ ในซีรัมของกลุ่มทดลองที่ให้วิตามินดีสูงกว่ากลุ่มควบคุม และกลุ่มทดลองที่ให้เฉพาะแร่ธาตุสูงถึง ๓ เท่า แต่ก็ลดลงอย่างรวดเร็วหลังจากนั้นเพียงสามวัน และเมื่อสิ้นสุดการทดลองที่อายุ ๓๖ วัน ความเข้มข้นของวิตามินดีในกระแสเลือดทุกกลุ่มก็ใกล้เคียงกัน
ภาพที่ ๕ ความเข้มข้นของ ๒๕-โอเอช-ดี ๓ ในซีรัมสัตว์ทดลองจากการทดลองครั้งที่ ๑ (I) และ ๒ (II)
ตัววัดด้านความแข็งแรงของกระดูกโครงสร้าง
ความหนาแน่นเฉลี่ยของกระดูกที่บริเวณแถบการเจริญเติบโตของกระดูกแข้งเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในช่วงอายุ ๑๖ ถึง ๒๔ วัน บ่งชี้ถึง พัฒนาการของกระดูกโครงสร้างอย่างรวดเร็วในช่วง ๒ ถึง ๓ สัปดาห์แรก แต่หลังจากนั้นช่วงอายุ ๒๔ ถึง ๓๖ วันเพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยเท่านั้น สิ่งที่น่าสนใจคือ เมื่อสัตว์ทดลองอายุ ๑๖ วัน ความหนาแน่นเฉลี่ยของกระดูกกลุ่มที่เสริมวิตามินดีต่ำที่สุด โดยยังแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) กว่ากลุ่มที่เสริมทั้งแร่ธาตุ และวิตามินดีจากการทดลองซ้ำทั้งสองครั้ง ขณะที่ การทดสอบปริมาณเถ้า พบว่า ปริมาณเถ้ากระดูกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในช่วงอายุ ๑๖ ถึง ๒๔ วันเช่นเดียวกัน และยังพบอีกว่า เมื่ออายุ ๑๖ วัน กลุ่มควบคุมที่ไม่ได้เสริมแร่ธาตุ และวิตามินดี มีปริมาณเถ้ากระดูกสูงกว่ากลุ่มทดลองที่ให้วิตามินดี และแร่ธาตุร่วมกับวิตามินดี
การตรวจสอบความแข็งแรงของกระดูก ที่อายุ ๑๖ และ ๓๖ วัน สัตว์ทดลองกลุ่มที่ให้ทั้งแร่ธาตุ และวิตามินดีละลายน้ำ มีความแข็งแรงมากกว่ากลุ่มอื่นๆ โดยสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเทียบกับสัตว์ทดลองที่ให้วิตามินดีอย่างเดียวที่อายุ ๑๖ วัน และสัตว์กลุ่มควบคุมที่ไม่ให้แร่ธาตุ และวิตามินดีที่อายุ ๓๖ วัน (p<0.05)
การเปลี่ยนแปลงของโปรตีนแคลบิดิน ดี ๒๘ เค ในลำไส้
ไม่พบการเปลี่ยนแปลงใดๆที่สัมพันธ์กับอายุไก่ หรือการเสริมวิตามินดีละลายน้ำ ลำไส้เล็กส่วนต้น ส่วนกลาง ประกอบด้วยโปรตีนแคลบินดิน ดี ๒๘ เค ปริมาณมากกว่าที่ลำไส้เล็กส่วนท้ายสองเท่า และไม่พบโปรตีนดังกล่าวที่เยื่อบุไส้ตัน การศึกษาครั้งนี้ เยื่อบุลำไส้ของไก่เนื้อไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของโปรตีนแคลบิดิน ดี ๒๘ สอดคล้องกับสมมติฐานที่ว่าอาหารที่มีปริมาณแคลเซียม และฟอสฟอรัสเพียงพอจะไม่กระตุ้นให้เกิดการดูดซึมแร่ธาตุแบบให้พลังงานเกิดขึ้น
ภาพที่ ๖ ผลการวิเคราะห์การปรากฏของโปรตีนแคลบิดิน ดี ๒๘ เค โดยการวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อต สังเกตการปรากฏสัญญาณเทียบมาร์กเกอร์เป็นแถบด้านซ้ายมือที่อยู่ระหว่างแถบ ๒๕ และ ๓๕ กิโลดัลตันที่ลำไส้เล็กส่วนต้น (Duo) และส่วนกลาง (Jeju) เป็นแถบเข้มมากกว่าส่วนท้าย (Ile) และไม่พบแถบสัญญาณที่ไส้ตัน (Cae) จากตัวอย่างส่วนของเหลวภายในเซลล์
บทสรุป
การเสริมวิตามินดีในการทดลองครั้งนี้มีระดับสูงกว่าปรกติ ๒๐ ถึง ๒๕ เท่า ขณะที่ การเสริมแร่ธาตุแคลเซียม และฟอสฟอรัสสูงกว่าปรกติร้อยละ ๐.๕ และร้อยละ ๒ ถึง ๓ ตามลำดับ ความผิดปรกติของโครงสร้างกระดูก ไม่จำเป็นต้องเกิดจากอาหารที่ไม่สมดุลเท่านั้น แต่อาจมาจากการรับน้ำหนักที่มากเกินไปทำให้โครงสร้างกระดูกแบกรับแรงไว้ไม่ไหว เชื่อว่า การเลี้ยงไก่เนื้อที่เจริญเติบโตอย่างรวดเร็วในระยะแรกอาจเป็นสาเหตุหลักที่ทำให้เกิดปัญหาขากระเผลก หรือขาเจ็บ ที่เป็นอาการเริ่มต้นก่อนพัฒนากลายเป็นขาพิการ การเสริมแร่ธาตุ และวิตามินดีละลายน้ำจึงไม่สามารถแก้ไขปัญหานี้ได้ โดยผลการวิจัยครั้งนี้ยืนยันให้เห็นได้จากทั้งผลผลิต ค่าโลหิตวิทยา การประเมินความแข็งแรงของกระดูกโครงสร้าง และการเปลี่ยนแปลงของโปรตีนแคลบิดิน ดี ๒๘ เค ในลำไส้
เอกสารอ้างอิง
Düngelhoef K, Wilkens MR, Mrochen N, Schröder B, Sander S and Kamphues J. 2014. Effects of an extra supply of vitamin D, calcium and phosphorus via drinking water on the calcium and phosphorus metabolism in growing chickens fed a conventional complete diet. Europ Poult Sci. 78. doi: 10.1399/eps.2014.24